Ta fram DNA ur en kiwi 

(v. 43)

Uppgift 

Vi ska ta fram rent DNA från cellerna i en kiwi och studera det genom mikroskop. Är detta möjligt?

Syfte 

Vi ska lära oss om och få förståelse för hur celler och dess DNA är uppbyggda. Vi ska även träna oss på att laborera och använda redskap och tekniker rätt.

Material 

• 1 mogen kiwi-frukt
• Flytande diskmedel: ca 1 cl
• Koksalt (NaCl)
• T-röd (95% alkohol), även kallat T-sprit
• Vatten (kranvatten fungerar utmärkt)
• Tre bägare á 20 cl
• Bägare á 10 ml
• Liten tratt
• 1 kaffefilter
• Sked & spatel
• Mikroskop (med tillbehör: objektglas, täckglas)

• ev. dator med programmet DinoXcope installerat, skulle fallet vara att mikroskopet råkar vara anpassat för detta.

Utförande 

OBS! Läs även felkällorna innan genomförandet av denna laboration.

1. Gröp ur innehållet i en kiwi och mosa detta i en bägare med hjälp av en sked. Finfördela fruktköttet så att så mycket fruktsaft som möjligt kan frigöras.

   

   Bilden visar den mosade kiwifrukten

2. Mät upp 1 cl diskmedel i den lilla bägaren och späd sedan med kallt vatten med proportionerna 1:9, med resultatet 10 cl vätska. Använd en av de större bägaren för det sistnämnda.

3. 

   100 ml (10 cl) av utspätt diskmedel har skapats

   Häll så mycket av vätskan över den mosade kiwin att fruktköttet precis täcks. Tillsätt sedan ca 3 g koksalt (natriumklorid) och blanda i ca en minut.

   

   Här syns hur vätskan precis täcker fruktköttet

4. Vik/rulla ihop ett kaffefilter så att det kan stoppas ned i en tratt. Häll på blandningen från punkt 3. Låt stå i cirka tio minuter, tills ca 20 ml har droppat ner i bägaren, som helst bör vara ren för att undvika föroreningar i observationen under mikroskop. Obs: försök inte påskynda filtreringen genom att peta i kiwi-smeten, se felkällor under Slutsats.

   

   I filtret kan man se fruktköttet och dess fasta massa. I bägaren nedanför syns filtratet som tunn vätska (tunn = låg viskositet).

5. Mät upp 20 ml iskall T-röd, så att volymen är densamma som filtratet. Du ska nu ha två bägare vars innehåll är lika i volym, men olika av innehåll.

   

   Bägaren till höger innehåller T-röd och bägaren till höger filtratet

6. Häll försiktigt ner T-röd, så att volymen i bägaren dubblas. Låt T-röd rinna långsamt utmed bägarens kant så att den skiktar sig över kiwifiltratet utan att blandas först!
7. Du kan troligen se hur mjölkvit DNA växer fram i gränsskiktet mellan alkoholen och filtratet. Dessa kan försiktigt lindas runt exempelvis en spatel och sedan dras (långsamt och försiktigt) upp DNA ur bägaren.  (bild på detta finns under Resultat)
8. Lägg en mycket liten fläck DNA på objektglaset (3*3 mm), och lägg på täckglaset. Pressa ned täckglaset för att platta till substansen och vätskan mellan glasen. Genom att göra detta eliminerar man felkällan att upptäcka andra substanser på olika fokus-avstånd, då bilden annars kan bli för ”djup”. Man får även en mindre suddig och istället klarare bild.

Hypotes 

Jag tror att vi kommer att lyckas med att extrahera DNA och möjligtvis sedan se det i mikroskop. Jag vet ännu inte exakt hur detta går till, men min hypotes är att diskmedlet och alkoholen bryter ner cellen och cellkärnan, vilket exponerar DNA. Jag grundar detta på flera laborationer som jag har gjort förr, då diskmedlet har haft för uppgift att sönderdela olika fetter, det är ju trots allt dess primära användningsområde och syfte i vardagen.
   Vad saltets exakta roll är är jag inte säker på än, men det återstår att se.

Riskbedömning

I denna laboration finns det inga stora risker, så länge man är försiktig. Då laborationen kräver att man handskas med en brandfarlig och hälsofarlig vätska, T-röd, och dessa risker måste iakttas. Men då vi under laborationen inte handskades med öppna lågor, sänks risknivån exponentiellt. Inget som görs i denna laboration ska förtäras (vilket gäller generellt i en laborationssal), så 

de enda två reella riskerna jag ser med alkoholen är följande:

  · Då laborationen vill att man använder nerkyld alkohol måste man vara försiktig. Alkohols smältpunkt ligger långt under den av vatten, så man kan underskatta hur kall flaskan faktiskt är. Man ser att den innehåller en flytande vätska, och antar att dess temperatur ligger över 0 °C, och utan att tänka på det greppar man den. Jag upplevde flaskan som förvånansvärt kall, nästan att det biter lite på huden.

  · Då alkoholens smältpunkt ligger så lågt, ligger även flampunkten lågt (temperaturen då ett ämne avger brännbara gaser i den koncentration att den kan antändas). Som nämnt ovan är detta inte så farligt ur brandsäkerhetssynpunkt, men gaserna finns ändå i luften. Dessa kan i för hög koncentration leda till att att man blir yr, och i värsta fall även försämra ens koordination, då det är möjligt att bli berusad av alkohol-ångorna. Därför är det viktigt att ha bra ventilation, och när man är klar med laborationen, att antingen diska ur bägarna direkt eller ställa dem i exempelvis ett dragskåp.

    Det kan även finnas personer med allvarlig kiwi-allergi, som får vara försiktiga vid blandningen och urgröpningen då det dels skvätter en del, och dels kan det komma ut kiwi-partiklar i luften.

Resultat

De två vätskorna skiktade sig i bägaren. Nedre vätskan bestod av kiwi-filtratet och den övre av T-röd. Efter några minuter kunde man se hur vita trådar lyftes från kiwi-filtratet och låg suspenderade i skiktet T-röd ovan. Se bild.

När det kom till att se på DNAt i mikroskop, var många oense om vad som faktiskt kunde vara DNA; men mer om detta senare, tro mig!

Slutsats

Utefter resultatet kan jag göra en slutsats att min hypotes stämde, och att vi kunde extrahera DNAt ur kiwi. De mjölkvita strängarna som växte fram är DNAt som frigjorts efter en rad biokemiska reaktioner, med bland annat saltet och diskmedlet. DNAt man ser är dock inte en kromosom eller en dubbelhelix (”DNA-repstege”), utan DNA ur miljontals celler, som är ihopklumpade och hålls ihop med hjälp av saltet.

   Detta är en ungefärlig förklaring på vad som händer:

Först sönderdelar diskmedlet cellväggen och cellmembranet, vilket öppnar cellen och frigör cellkärnan. Cellkärnan sönderdelas även, och anledningen till detta är att den vanligtvis skyddas av cellväggen och -membranet, och därför inte är särskilt robust. DNAt av flera miljoner celler blottställs för resten av vätskan och därmed saltet. Saltet har alltså för uppgift att med hjälp av laddningar sammanbringa DNA-trådarna från de många cellerna och hålla ihop dessa. Saltet binder även ihop alla restliga produkter, t ex de sönderdelade cellväggarna och -membranen.

   Små luftbubblor lyfter DNA-klumparna upp i T-röden, vilket gör att de blir synliga. Anledningen till att vi använder specifikt T-röd är:

  · T-röd och vatten har olika densitet och T-röd skiktar sig därför ovanpå vattnet. Detta gör att DNA-trådarna har någonstans att flyta, istället för att stanna kvar i en vatten-blandning.

  · T-röd har en låg fryspunkt, och därför kan man ha en lägre temperatur, (vilket krävs för att inte DNA ska sönderfalla eller skadas) och ändå kunna använda sig av en flytande vätska. Andra ämnen hade frusit annars, därför var T-röd utmärkt

  · T-röd är mycket genomskinlig, vilket gör att man kan se de enskilda DNA-klumparna lättare.

Så, detta var alltså hur vi extraherade DNAt ur kiwi. En slutsats jag kan dra av detta är att cellens membran och väggar består av fett, då de löses upp i diskmedel. Även om denna informationen är lite omvänd, då vi inte skulle använt diskmedel i första laget om det inte vore så att cellens membran är gjorda av fett, men det är ändå nyttig information och kan anses som en valid slutledning. Vi har även information nog för att få en förståelse för DNA och cellens samverkan och uppbyggnad.

Det finns ett par möjliga felkällor i denna laboration. Framför allt är det viktigt att T-spriten är kall för att inte sönderdela DNAt. Därför ska T-spriten förvaras i frys, ända tills strax före användning. Det är även av vikt att man genomför hela laborationen med hög precision. När man filtrerar kiwi-saften ska man undvika att skynda på det genom att peta i filtret. Det var flera som gjorde detta, vilket gjorde att filtret gick sönder och både filterpapper och kiwi-kärnor for ner i filtratet och förorenade detta.
   Använd gärna en våg som fungerar felfritt, för att mäta upp saltet. Vågen vi skulle använda var trasig, och det slutade med att man fick ögonmåtta mängden. Så fort man förlitar sig på människor, sjunker tillförlitligheten i metoden, och det kan påverka resultatet. Jag har en del erfarenhet i att ögonmåtta vikten av ett pulver, och kunde därför fortsätta med laborerandet. Andra, som inte har lika mycket erfarenhet, ögonmåttade möjligtvis fel och påverkade så slutresultatet.
   Man bör vara även försiktig när man ska skikta T-spriten över filtratet, och se till att den rinner ner långsamt längs med bägarens insida. Om man häller ner spriten direkt i filtratet, med starkt flöde, kommer det dels dröja längre tills de två vätskorna skiktas, då alkoholen först blandas med vattnet och sedan separeras, och dels kan det leda till avvikelser och skiljaktigheter i resultatet om DNA-extraktionen.

   En sista felkälla, som påverkar resultatet man ser i mikroskopet, kan vara erfarenhet i att använda mikroskop, och en oklar verklighetsbild på skala, vilket jag nu ska berätta om. Jag kommer att föra ett vetenskapligt resonemang eller diskussion om huruvida vi hade medel och resurser för att kunna observera DNA-dubbelhelixar genom mikroskop.

Det fanns diverse personer i parallellklasserna som hade tagit bilder genom mikroskopet på vad de trodde och vissa, var övertygade om, var DNA. Jag har valt att fokusera på en särskild, och diskutera om denna. Detta inte för att förolämpa personens förmågor eller omdöme, utan i syfte att skapa en vetenskaplig diskussion.

Vad vi ser på den här bilden är ett objekt som utan tvivel är vridet i en spiral. För det otränade ögat skulle detta onekligen kunna missuppfattas som en DNA-molekyl, om man inte har en uppfattning om skala. Faktum är att DNA är fruktansvärt litet, så litet till och med att det är fysiskt omöjligt att kunna se det med genom ett optiskt mikroskop som använder sig av ljus synligt för det mänskliga ögat. Objektet i fråga är alltså på molekylär nivå, och därmed mindre än själva våglängden av synligt ljus (vars lägsta våglängd ligger runt 380 nm), det är alltså helt omöjligt att se enskilda DNA-trådar genom ett optiskt mikroskop, som vi använde.

Istället behöver man ett elektronmikroskop för att kunna urskilja DNAs dubbel-helix, och även då endast med svårigheter, som bilden ovan visar. Bilden nedan visar hur stor en kromosom skulle kunna vara, nämligen upp till 20 mikrometer.

20 mikrometer är 1000 gånger större än 20 nanometer, och därmed faktiskt möjlig, om än med stora svårigheter, att observeras genom ett optiskt mikroskop. Det motsvarar en femtiondel av en millimeter, vilket faktiskt vore någorlunda möjligt att kunna observeras. Med denna kunskapen antog jag att det jag hade lyckats ta bild på var ett kluster av kromosomer, varav det jag trodde var en X-kromosom är inringat i rött.

Senare läste jag att DNA endast är i kromosomform precis innan celldelningen, och att det vanligtvis ligger löst i cellkärnan. Detta säger mig att det jag fick på bild inte alls kan vara kromosomer, då en plockad frukt inte utför celldelning längre, och sannolikheten att jag lyckades få bild på en avbruten celldelning är bokstavligt talat en i flera miljoner. Samtidigt så fick jag också reda på att även kromosomer (inte bara DNA) brukar fotograferas genom ett elektronmikroskop, vilket får mig anta att kromosomer inte är stora nog vanligtvis att få vettiga bilder genom ett optiskt för vetenskapligt bruk. På grund av dessa två anledningar tar jag tillbaka att min bild visar kromosom-kluster. Faktum är att jag konsulterade en forskare och doktor i biokemi, och han kan bekräfta att det vi ser inte är kromosomer. Han förklarar vidare att uppfattningen av skala dessutom är mycket skev på vissa bilderna, exempelvis denna:

Enligt bildens upphovsman (som väljer att förbli anonym) föreställer detta en kromosom, men som förklarat ovan är skalan felaktig. Detta kan man även utan kunskapen beskriven ovan, räkna ut, då ”pseudo”-kromosomen visas i samma bild som luftbubblor. Vem som helst med grundläggande naturkunskaper förstår att skalan för de två objekten är felaktiga. Även grundläggande kunskaper om hur man hanterar ett mikroskop är användbara. På så sätt hindras mer komplicerade misstag som detta, men även lätta misstag som att inte kunna hantera fokus som leder till att man tar bilder på repor i täckglaset eller dammkorn, som obestridligen ger felaktigt resultat, från att hända.

Vad är då anledningen till denna diskussion? Jag har två poänger med den:

   · Att fundera över laborationsrapportens upplägg. Det var mycket otydligt hur DNAt skulle se ut i mikroskopet. Jag har i min diskussion nyss bevisat att både DNA och kromosomer är omöjliga att se i optiska mikroskop, och dessutom förklarat varför 100x förstoring inte kommer att tjäna något till när man tittar på kromosom-kluster. Jag föreslår härmed alltså att ta bort mikroskop-parten av laborationen, för framtida laborationer, för att förhindra framtida missförstånd och onödig förvirring för alla elever; både för dem som inte riktigt förstår sig på allt, och dem som förklarar hur och varför förvirringen uppstår.

  · Att med hjälp av tydliga exempel förklara att mer undervisning som behandlar grundläggande kunskaper om naturkunskap och simpel logik är nödvändigt, och att visa att även de som anses vara på högsta nivå bör ta del av den.

Fallet kan naturligtvis vara så att det är med avsikt att man har lagt till den förvirrande mikroskop-delen, för att den enskilde eleven ska ifrågasätta sitt resultat och därmed skapa en vetenskaplig diskussion. Om så är fallet, är jag ett tydligt exempel på att planen har fungerat.

   För övrigt var denna laboration rolig att utföra och en av de mest intressanta att resonera kring, och framför allt mycket givande.